利用 AOTF 近紅外光譜儀檢測(cè)中藥中微生物的方法

摘?? 要??? 本文采用 AOTF 近紅外光譜技術(shù)以漫反射方式對(duì)新癀片中的微生物即細(xì)菌和霉菌進(jìn) 行光譜掃描，分別建立了偏最小二乘法（PLS1）回歸模型和主成分分析模型。通過(guò)偏最小二 乘法（PLS1），建立了菌體數(shù)量的回歸模型，并探討了菌體數(shù)量梯度對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的影響， 最終確定了以多模型分步快速菌檢法的預(yù)測(cè)方法。通過(guò)主成分分析模型，結(jié)果顯示 AOTF 技 術(shù)建立的數(shù)學(xué)模型不僅能夠分辨出樣品中的菌體數(shù)量是否合格，還能夠?qū)w是否具有活性 進(jìn)行定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AOTF-NIR Luminar 5030 光譜儀利用使用光譜數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)模型， 能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)新癀片中的菌體進(jìn)行定量分析和定性分析。

主題詞?? 聲光可調(diào)濾光器；近紅外光譜；微生物；偏最小二乘法（PLS1）

在中藥制藥行業(yè)，對(duì)細(xì)菌等微生物的的檢測(cè)按照國(guó)家藥典的規(guī)定是必須進(jìn)行的一項(xiàng)檢測(cè) 項(xiàng)目，常規(guī)的檢測(cè)方法是利用培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[1]，該方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí) 費(fèi)力，至少需要 48 小時(shí)才能得到最終的檢測(cè)結(jié)果，不能夠保持一個(gè)流暢的生產(chǎn)過(guò)程。如何 尋找一種快速的檢測(cè)方式，能夠迅速得到檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)中藥制藥行業(yè)的生產(chǎn)具有重大的意義。 近幾年在中國(guó)興起的近紅外檢測(cè)技術(shù)，作為一門(mén)獨(dú)立的分析檢測(cè)技術(shù)具有不需要樣品的預(yù)處 理，檢測(cè)速度快（秒級(jí)速度），不消耗試劑、綠色環(huán)保分析等特點(diǎn)，符合菌檢快速檢測(cè)的要 求，但是，能否利用近紅外技術(shù)對(duì)細(xì)菌等微生物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度如何？以往從 未見(jiàn)此方面的論文或報(bào)道。鑒于此，我們利用美國(guó) Brimrose 公司的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術(shù)近紅外光譜儀對(duì)廈門(mén)中藥廠(chǎng)有限公司提供的 20 個(gè)樣品進(jìn)行光譜采集，建立模型并 預(yù)測(cè)，以考察 AOTF-NIR 技術(shù)能否在菌檢項(xiàng)目中成功應(yīng)用。聲光可調(diào)濾光器（Acousto-optic tunable filter，簡(jiǎn)稱(chēng) AOTF）是基于各向異性的雙折射晶體的聲光衍射原理，利用超聲波 與特定的晶體作用而產(chǎn)生分光的光電器件[2,3,4]。與傳統(tǒng)的基于機(jī)械調(diào)諧分光元件的光譜儀器 相比，以 AOTF 作為分光元件的光譜儀具有明顯的優(yōu)越性：它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，光學(xué)系統(tǒng)無(wú)移動(dòng)性 部件，體積小，集光能力強(qiáng)，最吸引人之處在于它的掃描速度快、信噪比高[5]。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器條件和樣品處理

儀器：美國(guó) BRIMROSE 公司產(chǎn)的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術(shù)近紅外光譜儀，主要 部件包括：光學(xué)部分、控制部分、電源適配器、筆記本電腦。儀器波長(zhǎng)范圍為 1100nm 到 2300nm， 2nm 的波長(zhǎng)增量，掃描次數(shù)為 300，采用 InGaAs 檢測(cè)器。挪威 CAMO 公司 The Unscrambler 分析軟件。

樣品：新癀片不規(guī)則顆粒狀樣品 20 個(gè)，編號(hào)為 1-20，其中 1 號(hào)和 2 號(hào)樣品中的微生物 已經(jīng)殺死，為死菌體；3-20 號(hào)樣品中的微生物為活菌體。并提供每個(gè)樣品細(xì)菌數(shù)和霉菌數(shù) 的數(shù)據(jù)，單位為：個(gè)/克。見(jiàn)表 1 所示。

表 1: 樣品的編號(hào)及微生物個(gè)數(shù)值

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：?

本次實(shí)驗(yàn)掃描新癀片樣品數(shù)量 20 個(gè)，樣品狀態(tài)為不規(guī)則的顆粒狀。使用美國(guó) Brimrose 公司 Luminar 5030 型近紅外光譜儀采集樣品的光譜數(shù)據(jù)。將樣品放置于樣品盒的槽中，用 盒蓋將樣品刮平，連同盒蓋一起放置于支架上，光譜儀的探頭卡在樣品盒蓋的圓孔中，垂直 卡緊，采用漫反射的測(cè)樣方式采集光譜。每一張光譜都是 300 次掃描的平均結(jié)果。波長(zhǎng)范圍 從 1100nm 到 2300nm，波長(zhǎng)增量為 2nm。每個(gè)樣品均連續(xù)掃描 5 張光譜，共得到 100 張光譜。 將 100 個(gè)光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)一階微分處理（9 點(diǎn)平滑），導(dǎo)入 The Unscrambler 分析軟件，然后 利用 PCA 對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算創(chuàng)建定性校正模型；將細(xì)菌數(shù)和霉菌數(shù)的數(shù)據(jù)與樣品一一對(duì) 應(yīng)，采用 PLS1 方式進(jìn)行計(jì)算建立定量校正模型。

1.3 光譜及預(yù)處理

?新癀片樣品的原始吸收光譜（見(jiàn)圖 5），從圖中可以看出，所有光譜排列整齊有序，沒(méi) 有異常的樣品光譜。新癀片樣品的一階微分光譜（見(jiàn)圖 6），同樣整齊有序，有比較明顯的 吸收峰，光譜排列更加緊密，光譜與光譜之間的相似性較強(qiáng)，采集到的光譜信息量大。

2．建立 PLS1 定量分析模型

2.1 模型的建立

表 1 為所提供樣品的編號(hào)及每個(gè)樣品所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)和霉菌數(shù)的數(shù)據(jù)。在 The Unscrambler 軟件中，將每個(gè)樣品的光譜數(shù)據(jù)與細(xì)菌和霉菌個(gè)數(shù)的數(shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)，如圖 3 所 示。

采用偏最小二乘法（PLS1），完全交互驗(yàn)證（Full Cross Validation）的方式建立細(xì) 菌和霉菌的回歸定量分析模型。

2.2 結(jié)果分析

從圖 4 圖 5 的細(xì)菌和霉菌的回歸模型看：兩者都有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9791 和 0.9895。因此，我們可以初步判斷利用近紅外光譜可以得到微生物有效的信息。 因?yàn)榻⒛Ｐ退玫臉悠窋?shù)量比較少，無(wú)法進(jìn)行未知樣品的驗(yàn)證，因此，我們用所建 立的模型對(duì)所有掃描的光譜進(jìn)行一個(gè)內(nèi)部的驗(yàn)證，所得到的結(jié)果與外部驗(yàn)證相似，可以說(shuō)明

相同的問(wèn)題。表 2 是調(diào)用模型對(duì)細(xì)菌和霉菌的一個(gè)驗(yàn)證結(jié)果：

表 2.模型對(duì)細(xì)菌和霉菌的預(yù)測(cè)結(jié)果

從表 2 可以看出：細(xì)菌數(shù)量大于 300 個(gè)的樣品和霉菌數(shù)量大于 600 個(gè)的樣品的模型預(yù) 測(cè)結(jié)果都接近于實(shí)際值，比較準(zhǔn)確。但是對(duì)數(shù)量比較少的樣品預(yù)測(cè)的結(jié)果差別非常大。這是 因?yàn)閮蓚€(gè)模型的數(shù)據(jù)梯度非常大，數(shù)據(jù)從幾個(gè)到幾千，在這么寬的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，由于樣品量 有限，沒(méi)有很好的梯度間隔，而且，微生物個(gè)數(shù)少的樣品其信號(hào)反應(yīng)也相對(duì)較弱，因此，很 難預(yù)測(cè)其準(zhǔn)確的個(gè)數(shù)。

2.3 模型的改進(jìn)

針對(duì)細(xì)菌而言，如果我們的最終結(jié)果只是要求將細(xì)菌的個(gè)數(shù)控制一個(gè)數(shù)量之下，

比如少于 7000 個(gè)為合格，那么以上模型雖然對(duì)細(xì)菌少的樣品預(yù)測(cè)不夠準(zhǔn)確，但能夠達(dá)到控

制的要求。對(duì)于霉菌來(lái)說(shuō)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求是少于 100 個(gè)為合格，那么我們換一個(gè)思路，用霉

菌數(shù)量少于等于 100 個(gè)的樣品建立霉菌的模型，看能夠達(dá)到什么樣的預(yù)測(cè)效果。在掃描的 100 個(gè)光譜中，霉菌數(shù)量 100 個(gè)以下的樣品的光譜個(gè)數(shù)共為 55 個(gè)。利用這 55 個(gè)光譜數(shù)據(jù)和 對(duì)應(yīng)的霉菌個(gè)數(shù)值，建立 100 個(gè)以下霉菌的模型，見(jiàn)圖 6。

從圖 6 可以看出，霉菌小范圍模型有更好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了 0.9913,利用這個(gè)

模型對(duì)建模用的 55 個(gè)光譜進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到表 3 的結(jié)果。

表 3.霉菌 100 以下小范圍模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值的比較

從表 3 可以看出：霉菌的 100 以下小范圍模型對(duì) 100 個(gè)以下的樣品預(yù)測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確度非 常高，只有正負(fù)幾個(gè)的絕對(duì)偏差。小范圍模型預(yù)測(cè)霉菌數(shù)量少的樣品比較準(zhǔn)確，那么預(yù)測(cè)霉 菌數(shù)量大于 100 個(gè)的樣品的結(jié)果會(huì)怎么樣？表 4 是霉菌數(shù)量大于 100 的樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果。

表 4.小范圍模型預(yù)測(cè)霉菌數(shù)量大于 100 的樣品的結(jié)果

從表 4 可以看出：霉菌數(shù)量小于 100 的樣品所建立的小范圍測(cè)試模型預(yù)測(cè)霉菌數(shù)量大 于 100 的樣品的結(jié)果與實(shí)際值相差很大，這是正常的，因?yàn)樗鶞y(cè)試的樣品范圍不在建模范圍 之內(nèi)，預(yù)測(cè)的結(jié)果肯定是不準(zhǔn)確的。我們可以嘗試用霉菌的數(shù)量小于 600 個(gè)的所有樣品再建 立一個(gè)模型。在掃描的 100 個(gè)光譜中，霉菌數(shù)量小于 600 個(gè)的樣品的光譜個(gè)數(shù)共為 75 個(gè)。 利用這 75 個(gè)光譜數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的霉菌個(gè)數(shù)值，建立 600 個(gè)以下霉菌的模型，見(jiàn)圖 7。

從圖 7 可以看出，霉菌 600 個(gè)以下的模型也有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為 0.9823,利用

這個(gè)模型對(duì)建模用的 75 個(gè)光譜進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到表 5 的結(jié)果。

表 5.霉菌 600 個(gè)以下的模型預(yù)測(cè)霉菌數(shù)量小于 600 個(gè)的樣品的結(jié)果

從表 5 可以看出：霉菌 600 個(gè)以下的模型對(duì)霉菌數(shù)量為 170、200、250、600 個(gè)的四個(gè) 樣品預(yù)測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確度很高；對(duì)霉菌數(shù)量 100 個(gè)以下的樣品預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度降低，但每個(gè)樣品的 平均值仍然能夠接近于實(shí)際值。

2.4 綜合解決方案

綜合以上的分析，在如此大的數(shù)據(jù)梯度范圍內(nèi)，我們沒(méi)有辦法只用一個(gè)模型就能夠測(cè) 量準(zhǔn)確所有的樣品。但是，分析本次實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)建立三個(gè)模型就可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)每一個(gè) 樣品的霉菌數(shù)量（細(xì)菌與此類(lèi)似，不再作詳細(xì)分析），這三個(gè)模型是：所有樣品參與建立的 寬數(shù)據(jù)范圍的綜合模型，我們不妨稱(chēng)其為 model-all；霉菌數(shù)量小于 600 個(gè)樣品建立的模型 稱(chēng)為 model-1000；霉菌數(shù)量小于 100 個(gè)樣品建立的小范圍模型稱(chēng)為 model-100。

分析表 2，霉菌個(gè)數(shù)在 1000 個(gè)以上的樣品預(yù)測(cè)的非常準(zhǔn)確，個(gè)數(shù)在 1000 個(gè)以下的樣品 預(yù)測(cè)值沒(méi)有超過(guò) 1000 的，因此，通過(guò) model-all 的預(yù)測(cè)，可以有效地將霉菌個(gè)數(shù)在 1000 個(gè) 以上的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

分析表 5，利用 model-1000 模型，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)霉菌數(shù)量 100 個(gè)以上的樣品。霉菌數(shù) 量 100 個(gè)以下的樣品預(yù)測(cè)不夠準(zhǔn)確。

分析表 3，利用 model-100 模型，對(duì)霉菌數(shù)量在 100 個(gè)以下的樣品預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度非常高。

根據(jù)以上分析總結(jié)，完全可以利用 AOTF-NIR 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速菌檢的工作。步驟如下： 掃描未知樣品的光譜，首先用 model-all 模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值大于 1000，那么，該樣品 的霉菌數(shù)量即為該數(shù)值；如果樣品的預(yù)測(cè)值小于 1000，用 model-1000 模型再對(duì)該樣品的光 譜進(jìn)行預(yù)測(cè)，如果預(yù)測(cè)值在 200-1000 范圍之內(nèi)，那么我們可以肯定該樣品的預(yù)測(cè)值為該樣

品的真實(shí)值，如果預(yù)測(cè)值在 100-200 范圍內(nèi)，那么我們需要對(duì)該樣品重復(fù)掃描 5 次，用 model-1000 模型預(yù)測(cè) 5 次光譜的平均值，即為該樣品的真實(shí)值；如果用 model-1000 模型預(yù) 測(cè)該樣品光譜的預(yù)測(cè)值小于 100，那么，再調(diào)用 model-100 模型對(duì)該樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)， 得到的結(jié)果就是該樣品的實(shí)際值。

3．分析菌體數(shù)量是否合格

3.1 定性模型的建立

多模型分步快速菌檢法非常適合 AOTF-NIR 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室快速對(duì)藥品中的微生物進(jìn)行檢 測(cè)，但是，該方法相對(duì)復(fù)雜，不能夠適應(yīng)在線(xiàn)的快速微生物檢測(cè)，下面我們來(lái)探討一下用定 性分析的方法，能否解決在線(xiàn)菌檢的工作。

還是以霉菌為例。定性分析和定量分析是兩個(gè)不同的概念，定量分析可以檢測(cè)到一個(gè) 樣品中含有的霉菌的具體個(gè)數(shù)；定性分析是判斷是與否的問(wèn)題，假設(shè)規(guī)定藥品中含有霉菌的 個(gè)數(shù)超過(guò) 100 個(gè)為不合格，少于 100 個(gè)為合格品，那么定性分析就是判斷所檢測(cè)的藥品是否 合格的問(wèn)題。

在已有的 20 個(gè)樣品中，11 個(gè)樣品的霉菌個(gè)數(shù)不超過(guò) 100，9 個(gè)樣品的霉菌個(gè)數(shù)在 100 個(gè)以上。利用主成分分析（PCA）對(duì) 11 個(gè)樣品的一階微分光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，作為合格樣品 集；對(duì) 9 個(gè)樣品的一階微分光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，作為不合格樣品集。因?yàn)槊總€(gè)樣品我們掃描 了 5 張光譜，我們可以將每個(gè)樣品的第一張光譜分出來(lái)，作為驗(yàn)證用，其余的 4 個(gè)光譜參與 建立定性分析的模型。這樣，合格樣品集有 11 張驗(yàn)證光譜，不合格樣品集有 9 張驗(yàn)證光譜。 44 張合格品光譜建立的定性模型為 yes，36 個(gè)不合格品樣品建立的定性模型為 no，見(jiàn)圖 8 和圖 9。